1. 生產(chǎn)工藝流程

本項(xiàng)目運(yùn)營期主要進(jìn)行基因治療藥物研發(fā)小試實(shí)驗(yàn)，主要工藝流程如下：

1. 分子克隆：采用DNA提取試劑盒提取HK293T細(xì)胞中DNA，得到DNA模板。外購引物使用PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增DNA模板，得到PCR產(chǎn)物。外購質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切，用連接酶將質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物。此過程中產(chǎn)生廢試劑盒、廢液、廢包裝材料。
2. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌NEB Stbl3溶液進(jìn)行混合，混合物涂布于含卡那霉素、氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基（由氯化鈉、瓊脂粉、酵母粉、蛋白胨按照比例配制而成），篩選出轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，挑選單個(gè)菌體至含卡那霉素、氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基（由氯化鈉、酵母粉、蛋白胨按照比例配制而成）進(jìn)行培養(yǎng)。此過程中產(chǎn)生廢包裝瓶、廢液、廢實(shí)驗(yàn)耗材。
3. 質(zhì)粒提取：將結(jié)合柱裝入離心管，置于離心機(jī)中離心，將結(jié)合柱裝入一新的EP管中，室溫放置數(shù)分鐘以確保乙醇揮發(fā)干凈。在膜中央小心加入TE（由Tris-HCl與EDTA按照比例配制而成），不要戳破膜。室溫放置2分鐘，置于離心機(jī)中離心，離心管中即為抽提的去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA。
4. 瓊脂糖凝膠制備：用純水將制膠工具洗干凈，準(zhǔn)備好制膠平板，用瓊脂將模具邊緣封閉，架好梳子；根據(jù)要分離的樣品（DNA）大小配制合適濃度的瓊脂糖凝膠。
5. 種子培養(yǎng)：取含有目的質(zhì)粒的大腸桿菌甘油管在超凈工作臺(tái)上接種至裝有LB培養(yǎng)基（Tryptone 10g/L，Yeast Extract 5g/L，NaCl 10g/L）的試管或小三角瓶中，同時(shí)加卡那霉素母液，防止污染以及污染引起的形態(tài)或生理變化，在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)以一定轉(zhuǎn)速培養(yǎng)8~15h。此過程中產(chǎn)生廢包裝瓶、廢液、廢培養(yǎng)基。
6. 大搖培養(yǎng)：取培養(yǎng)好的種子按比例液添加到裝有LB培養(yǎng)基的三角瓶中，同時(shí)加卡那霉素母液，防止污染以及污染引起的形態(tài)或生理變化，在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)以一定轉(zhuǎn)速培養(yǎng)15~17h。此過程中產(chǎn)生廢包裝瓶、廢液、廢培養(yǎng)基。
7. 離心收集：使用離心機(jī)進(jìn)行離心，收集下層菌體，離心的上清液加入氫氧化鈉滅菌，此過程中有廢包裝瓶、廢離心管、廢離心液。
8. 試劑盒法抽提質(zhì)粒：利用試劑盒中的試劑對(duì)上述步驟中收集的菌體進(jìn)行裂解和質(zhì)粒抽提。根據(jù)菌體量和質(zhì)粒用途選用不同規(guī)格或品牌的試劑盒進(jìn)行抽提。此過程中產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)廢氣、廢液、廢培養(yǎng)基、廢試劑盒。
9. 瓊脂糖電泳檢測(cè)：與上述步驟一致，此過程產(chǎn)生廢液、廢實(shí)驗(yàn)耗材、廢包裝瓶、凝膠廢氣。
10. 細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮罐HEK293T工作細(xì)胞庫取出一支凍存管，鋪板HEK 293T細(xì)胞（含SV40片段，此片段可使細(xì)胞擴(kuò)增），于37℃水浴鍋中快速解凍，在生物安全柜中接種至含10%胎牛血清、谷氨酰胺替代物的DMEM培養(yǎng)基中，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。該過程產(chǎn)生廢棄耗材（凍存管、移液管、離心管等）和廢培養(yǎng)基。
11. 細(xì)胞擴(kuò)增：細(xì)胞復(fù)蘇后，在含有10%胎牛血清谷氨酰胺替代物的DMEM培養(yǎng)基中，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)至一定的規(guī)模，擴(kuò)增過程使用胰酶替代物消化細(xì)胞，使用PBS溶液清洗去掉胰酶替代物。該過程產(chǎn)生廢棄耗材（移液管、離心管、培養(yǎng)瓶等）和培養(yǎng)廢液。
12. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：細(xì)胞擴(kuò)增至一定規(guī)模后，轉(zhuǎn)染試劑PEIpro和3質(zhì)粒形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物導(dǎo)入HEK293T細(xì)胞中產(chǎn)生重組AAV病毒，此過程在P2實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜中進(jìn)行。該過程產(chǎn)生廢棄耗材（移液管、離心管、槍頭、注射器、濾器、儲(chǔ)液瓶、培養(yǎng)瓶等）和培養(yǎng)廢液。
13. 細(xì)胞裂解
14. 層析、純化：通過親和層析，使用層析緩沖液（由一水合檸檬酸、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷按照比例配制而成）稀釋AAV病毒，有親和能力的AAV病毒附著在層析柱上，無親和能力的大部分的雜質(zhì)進(jìn)入過柱廢液，實(shí)現(xiàn)與AAV病毒的分離。
15. UF/DF過濾
16. 檢測(cè)：加入蛋白酶K、SDS使病毒失活，進(jìn)行QPCR檢測(cè)、ELISA檢測(cè)、WB檢測(cè)、無菌檢測(cè)、內(nèi)毒素檢測(cè)，檢測(cè)病毒純度、滴度。WB檢測(cè)前使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）檢測(cè)蛋白濃度，使用酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)。
17. QPCR檢測(cè)：檢測(cè)基因外顯子區(qū)域大片段缺失或重復(fù)的一種技術(shù)。將DNA放入0.2ml八排單管，加入SuperReal，并蓋上管蓋，置于QPCR儀中檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，從而判斷模板起始拷貝數(shù)。主要使用試劑為dsDNA HS Assay Kits、HI-DI formamideBOTTLE、擴(kuò)增試劑、SuperReal（熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版）等，此過程中產(chǎn)生廢液、實(shí)驗(yàn)耗材。
18. SDS-PAGE凝膠檢測(cè)：SDS-PAGE凝膠分為分離膠和濃縮膠，制作工序相同，使用的溶液濃度及體積略有不同，凝膠現(xiàn)制現(xiàn)用。加入SDS、TRIS鹽酸（分離向細(xì)胞樣品或者動(dòng)物組織加入RIPA裂解液，使用超聲波破碎儀破碎，離心吸取上清，即得到提取的蛋白，使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。在加樣孔中加入重組抗體蛋白，進(jìn)行凝膠電泳。
19. 無菌檢測(cè)：將樣品分別取5ul接種于3管硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和1管胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。分別于30~35℃和20~25℃培養(yǎng)14天。如果培養(yǎng)基渾濁則結(jié)果可確定為陽性，如果清澈透明則為陰性。
20. 內(nèi)毒素檢測(cè)：核酸及蛋白提取步驟：采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞或動(dòng)物組織中的mRNA；加入RIRA裂解液勻漿破碎細(xì)胞并離心，提取細(xì)胞或動(dòng)物組織中的蛋白質(zhì)。此過程會(huì)產(chǎn)生廢棄耗材、廢液和廢棄的細(xì)胞及組織殘?jiān)?。qPCR檢測(cè)步驟：利用一步法試劑盒將提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此做好對(duì)照，在冰上或者4度孵育20分鐘，也可以在常溫下孵育15分鐘。加入流式染色緩沖液，1200轉(zhuǎn)離心5分鐘，去上清。重復(fù)一次再次洗滌去上清。加入流式染色緩沖液500uL重懸。如果是石蠟切片染色，則前處理為：65度烘片，二甲苯脫蠟，梯度無水乙醇水化，水洗，Tris-EDTAbuffer修復(fù)抗原，1xPBS洗滌?？乖迯?fù)后滴加免疫染色封閉液進(jìn)行抗原封閉，加入一抗稀釋液進(jìn)行孵育，1xPBST浸洗，加入二抗稀釋液進(jìn)行孵育，1xPBST浸洗，加入DAPI染液進(jìn)行染色，加入1xPBS清洗，滴加抗熒光淬滅封片劑蓋上蓋玻片。此過程會(huì)產(chǎn)生廢棄耗材、各種試劑的清洗廢液及揮發(fā)性氣體二甲苯、乙醇、異味氣體。

基因治療藥物研發(fā)工藝流程及產(chǎn)排污環(huán)節(jié)分析見圖1-1、圖1-2。

2. 生產(chǎn)設(shè)備

本項(xiàng)目主要研發(fā)設(shè)備見表2-1。